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荧光定量PCR的2个概念和特点

将荧光基团加入到PCR反应体系中,通过不断累积荧光信号从而使对PCR全程的实时监测实现,再根据标准曲线定量分析未知模板的方法,即是荧光定量PCR技术。在实时荧光定量PCR中,实时检测全程PCR扩增过程,按照反应时间和荧光信号的变化能够将一条曲线绘制成。


两个概念

1.Ct值

t代表threshold,C代表Cycle,每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数,即为Ct值的含义。


2.荧光域值(threshold)的设定

荧光本底信号为PCR反应的前15个循环的荧光信号,3~15个循环的荧光信号标准偏差的10倍为荧光域值的缺省设置。

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传统定量只能终点检测的不足之处,通过实时荧光定量PCR技术可以将其有效的解决,使得荧光信号的强度每一轮循环就能够检测一次并且在电脑上记录下来得以实现。在电脑软件之中,通过计算每个样品Ct值,按照标准曲线就能将定量结果得到。所以基于如下两点,实时荧光定量PCR可以不需要内标。


a.Ct值与起始模板的线性关系

因为Ct值与起始模板的对数存在线性关系,未知样品的定量测定能够根据标准曲线。所以实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。


b.Ct值的重现性

PCR循环在到达Ct值所在的循环数时,真正的指数扩增期(对数期)刚刚进入,这个时间误差很小,还没有被放大,所以Ct值有极好的重现性,也就是时间相同不同管内扩增或者不同时间相同模板扩增,会得到相同的Ct值。


特点

1.重复性好

2.检测速度快

3.自动化程度高

4.特异性强

5.灵敏度高


2019-07-11 17:43:26 浏览次数:245次