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DNA提取常见问题(二)

核酸提取仪是应用配套的核酸提取试剂来使得样本核酸提取工作自动完成的仪器。其在环境微生物检测、食品安全检测、输血安全、法医学鉴定、疾病控制中心、临床疾病诊断、生物学研究以及畜牧业等多种领域得到广泛地应用。下面就让小编带你了解一下DNA提取的常见问题。


常用方法

1.为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚?呈粉红色的酚可否使用?如何保存酚不被空气氧化?

由于酚与水有一定的互溶,抽提DNA过程中,不会造成样品中含有DNA的水分被吸收,使得DNA的损失减少为苯酚用水饱和的目的。使用Tris将pH调节为8,是由于在此条件下,DNA比较稳定。在中性或碱性条件下(pH5~7),和DNA相比较,RNA游离到水相更加的容易,因此能够使RNA含量较少的DNA样品获得。在冰箱中保存的酚,容易被空气氧化而变成粉红色的,DNA容易受到这样的酚的作用而降解。为了使酚的氧化第一避免,能够将疏基乙醇和8-羟基喹琳加入直到至终浓度为0.1%。8-羟基喹琳是固体粉末,带有淡黄色,不但可以氧化,还能够在一定程度上对DNase的活性起到抑制作用,其为金属离子的弱螯合剂。使用TrispH8.0水溶液饱和后的酚,最好在棕色小试剂瓶里分装,将一层Tris水溶液或TE缓冲液在上面盖上,使空气隔绝,将其装满盖紧盖子最好。若有可能,能够将氮气充入,使与空气接触而被氧化得以避免。平时在4℃或-20℃冰箱中保存,使用时,将盖子打开吸取后将盖子迅速盖上,如此能够使酚可用数月不变质。


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2.为什么用酚与氯仿抽提DNA时,还要加少量的异戊酵?

在抽提DNA时,为了混合均匀,必须将容器剧烈振荡数次,在这个时候,在混合液内容易有气泡产生,气泡会对相互间的充分作用起到阻止功能。将异戊醇加入可以使分子表面张力降低,因此,能够使得抽提过程中的泡沫产生减少。通常氯仿与异戊酵的采用比例为24:1。同时异戊醇对分相很有帮助,可以维持离心后的上层水相,中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相稳定。


3.抽提DNA去除蛋白质时,怎样使用酚与氯仿较好?

水是极性分子,酞与氯仿是非极性分子,当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时,酚或氯仿就会挤去蛋白质分子之间的水分子,使蛋白失去水合状态而变性。变性蛋白质的密度经过离心以后大于水的密度,所以和水相分离,在水相下面沉淀,从而和在水相中溶解的DNA分开。而而酚与氯仿有机溶剂有着更大的比重,在最下层保留。作为表面变性的酚与氯仿,对于蛋白质的去除,各有利弊,酚的变性作用更大,然而酚与水相有一定程度的互溶,在酚相中大约溶解0%~15%的水,所以使得这部分水相中的DNA损失了,然而氯仿没有如酚一般好的变性作用,然而氯仿与水不相混溶,,不会将DNA带走。因此在抽提过程中,想要达到最好的效果,应当混合使用酚与氯。经酚第一次抽提后有酚残留在水相中,因为酚与氯仿是互溶的,能够使用氯仿对蛋白质进行第二次变性,在这个时候,能够带走酚。也能够在第二次抽提时将酚与氯仿以1:1的比例混合使用。


2019-08-13 17:47:49 浏览次数:41次

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